Sena Kobayakawa est le chétif personnage principal du manga, responsable et surtout running back des Deimon Devil Bats. Il n'a aucun ami, excepté Mamori qui veille sur lui depuis l'enfance, et une confiance en lui proche de zéro. Ainsi, depuis la maternelle, les autres profitent de sa timidité et de sa fragilité pour s'en servir comme larbin. Mais à force de courir partout pour eux, il finit par développer une vitesse remarquable. Lorsqu'il entre en première année au lycée Deimon, il cherche un club pour se faire des amis. Par un concours de circonstances, il vient à parler avec le gentil Kurita de l'équipe de football américain. Constatant le faible nombre de joueurs (ils ne sont que 2 avec Hiruma) mais effrayé par la brutalité de ce sport, il se propose comme responsable. Hiruma, qui l'a déjà vu courir, sent qu'il tient un joueur de choix pour son équipe et le fait rapidement jouer sur le terrain. C'est ainsi que Sena devient le running back de l'équipe, bien caché derrière sa visière teintée pour que son identité reste confidentielle. Au fur et à mesure des épreuves traversées, il développe des techniques personnelles telles que le Devil Bat Ghost, ou le Devil Bat Hurricane, mais également une envie de se surpasser afin de devenir un membre responsable sur qui on peut compter.

Mamori Anezaki est l'amie d'enfance de Sena et son ainée d'un an (Sena la surnomme "grande soeur" ce qui est courant au japon envers une proche plus âgé) ; elle le défend depuis des années contre ceux qui lui veulent du mal. Encore aujourd'hui, elle s'occupe de lui telle une mère-poule un peu envahissante. Au début de l'histoire, Mamori vient de rentrer en deuxième année au lycée Deimon et appartient au comité de discipline. Connaissant Hiruma, elle craint pour Sena lorsque celui-ci rejoint les Deimon Devil Bats et l'enjoint même à quitter le club. Comme Sena refuse, elle devient manager de l'équipe pour pouvoir continuer à veiller sur lui. Comme Loïs Lane dans Superman, elle ne reconnaît plus Sena lorsqu'il est Eyeshield 21.

Yōichi Hiruma le quaterback de l'équipe, est en deuxième année au lycée Deimon, et constitue le principal élément délirant de l'histoire. Dans la vie de tous les jours, son intelligence lui permet d'inventer toutes sortes de combines et de manipulations pour parvenir à ses fins. Il collectionne par exemple des informations compromettantes sur tout le monde, afin de pouvoir exiger ce qu'il veut à n'importe qui en cas de besoin, informations qu'il conserve dans son fameux "carnet de menace" qu'il n'hésite jamais à utiliser. Toujours prompt à sortir la mitraillette ou le bazooka, c'est un démon craint de tous. Sur le terrain, même s'il est aussi effrayant pour ses coéquipiers, c'est aussi un fin tacticien qui comble les lacunes de ses joueurs (dont la plupart sont des élèves forcés à jouer par le chantage, ne faisant même pas partie du club) par des stratégies diverses et parfois peu scrupuleuses. En plus de son intelligence, Hiruma est un quater back aux passes expertes.

Ryōkan Kurita le center de la ligne des Deimon Devil Bats, est en deuxième année à Deimon tout comme Hiruma. Véritable colosse tout rond et souriant, c'est une présence rassurante de l'équipe en contraste face à Hiruma, c'est d'ailleurs lui qui explique petit à petit à Sena les règles du football américain. Sa taille et son poids considérables (Kurita est un grand amateur de pâtisseries) en font un joueur au plaquage particulièrement redoutable.

Depuis tout petit, Tarō Raimon est fan de base-ball. Il s'est même juré de devenir aussi fort que Honjô, un ancien joueur professionnel pour qui il nourrit une admiration sans bornes. Seulement, si ses réceptions sont excellentes, ses transmissions de balle sont désastreuses, ce qui lui coûte sa place dans l'équipe de base-ball du lycée Deimon. Sena lui demande alors de rejoindre l'équipe de football américain, qui a vraiment besoin d'un bon wide receiver. Si au début Tarô refuse, la présence de Mamori et quelques manigances de Hiruma le décident à intégrer l'équipe. Surnommé Monta, il est souvent qualifié de singe à cause de sa tête et de sa capacité à manger ou de saisir des objets, avec ses pieds. Autrement, c'est le premier à remarquer qu'Eyeshield 21 est en réalité Sena. Devenu wide receiver dans l'équipe de Deimon, il découvre son potentiel à ce poste et réalise d'impressionnantes réceptions comme la réception à une main ou le "Devil Backfire" (une réception de la balle de dos en pleine course).

Daikichi Komusubi voue une profonde admiration à Kurita, qu'il considère comme son maître, et veut donc lui aussi devenir lineman. Il demande à rejoindre l'équipe après le match contre les Caméléons du bahut des rebelles et passe avec succès le test de la tour infernale. Il semble avoir de grandes difficultés à s'exprimer verbalement, excepté avec les "hommes forts" qui sont les seuls avec qui il communique étonnamment bien (en utilisant le langage du "Virilisme")
Ayant passé toute sa vie à étudier jusqu'ici, Manabu Yukimitsu aimerait se faire quelques bons souvenirs avant de quitter le lycée. C'est pour cette raison qu'il demande à intégrer l'équipe, en le cachant à sa mère car celle-ci s'opposerait à ce qu'il rejoigne un quelconque club au lieu d'étudier. D'un physique plutôt frêle, il a du mal à trouver sa place au sein de l'équipe, mais fait tout pour être reconnu par ses coéquipiers.Il évolue au poste de wide receivers

Ishimaru Tetsuo est le second Running Back. Il fait parti du club d'athlétisme du lycée et a été recruté par Sena. Ishimaru est une telle discrétion que presque personne ne le remarque, ce qui se révèle un avantage dans certains matches.

Sous le surnom des "Frères Ha ha" se cachent 3 voyous du Lycée Deimon que l'on voit toujours ensemble : Kazuki Jūmonji, Kōji Kuroki et Shōzō Toganō , leur surnom leur venant de Hiruma à cause de leur tic de langage, le fameux "Hein ? Heinn ? Heinnn ?!". S'en étant pris à Sena dans le premier tome, celui-ci réussissant à leur échapper grâce à sa vitesse, Hiruma pris des photos compromettantes d'eux afin qu'ils ne touchent plus à nouveau à sa nouvelle recrue. Suite à divers concours de circonstances (la recherche des négatifs de ces photos et une forte rivalité avec Daikichi), ils rejoignirent un peu malgré eux les rangs de l'équipe en tant que linemen.
Gen Takekura, dit Musashi, le "magnum des 60 yards" comme le surnomme Hiruma, était le kicker des Deimon Devil Bats, du temps où il jouait avec Kurita et Hiruma. Il dut quitter l'équipe suite a un accident de son père, et travaille donc désormais à sa place dans son entreprise de charpentier, construisant les nouveaux locaux des Deimon Devil Bats à chacune de leurs victoires. Il fera son retour dans l'équipe lors du match contre les Seibu Wild Gunmans dans le tome 17.